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生殖道微生态专题

甲硝唑治疗细菌性阴道病前后阴道菌群的 结构变化及其预后相关性

分类:
细菌性阴道病
发布时间:
2017/01/14 17:16
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甲硝唑治疗细菌性阴道病前后阴道菌群的
结构变化及其预后相关性 
牛小溪1,肖冰冰1,王奔1,2,那日苏1,廖秦平2
1.北京大学第一医院妇产科,北京100034;2.北京清华长庚医院妇产科,北京102218
摘要目的 研究经甲硝唑规范治疗的细菌性阴道病患者在用药后6~8d随访时的菌群结构与治疗前以及治疗结局之间的关系,探讨治愈人群与治疗失败人群在6~8d这一观察点的阴道菌群多样性的差异,从而为实现细菌性阴道病治疗结局的预测提供理论依据。方法 选取2012年9月至2013年7月在北京大学第一医院妇产科门诊诊断为细菌性阴道病的育龄期女性为研究对象,规范使用甲硝唑凝胶治疗,分别采集患者用药前、用药后6~8d、用药后1个月的阴道分泌物,提取细菌组DNA,进行454焦磷酸测序,分析阴道微生物菌群的多样性和丰度差异,探讨细菌性阴道病患者阴道菌群的构成差异与预后之间的相关性。结果 共61名患者完成了2次随访,共计183份阴道分泌物样品。对所有采集的标本进行454焦磷酸测序分析,共发现192种细菌。用药后6~8d的革兰染色涂片结果显示所有患者的阴道菌群镜下可分为三种情况:正常菌群、菌群抑制、异常菌群。镜检涂片为正常菌群的治愈率最高,其次是菌群抑制,异常菌群的治愈率最低。454焦磷酸测序分析显示甲硝唑治疗前后菌群的多样性和丰度发生了一定程度的变化,乳杆菌和球菌的含量未受明显影响,而细菌性阴道病致病菌的含量明显减少。结论 甲硝唑可以有效减少细菌性阴道病致病菌的数量而不影响乳杆菌的含量,但是对以球菌为主的患者治疗效果差。对高通量测序结果和革兰染色涂片结果的综合分析显示甲硝唑用药后6~8d的阴道菌群对细菌性阴道病1个月后的治疗结局具有预测价值。
关键词:细菌性阴道病;甲硝唑;高通量测序;革兰染色
中图分类号:R711.3  文献标志码:A  文章编号:1005-376X(2016)07-0831-06
DOI编码:10.13381/j.cnki.cjm.201607022
细菌性阴道病(bacterialvaginosis,BV)是育龄期女性最常见的下生殖道感染性疾病,发病率为10%~30%[1]。正常阴道微生态菌群的构成发生变化,即维持正常阴道酸性环境的优势菌乳杆菌减少,而其他多种微生物(主要为厌氧菌)增多是导致BV发生的主要原因[2],但其具体的病因尚不明确[3]。细菌性阴道病可以增加女性对盆腔炎、早产HPV感染以及多种性传播疾病的易感性[4-6]。目前临床应用甲硝唑和克林霉素按标准方案治疗BV,虽然抗菌治疗可以有效地缓解BV的临床症状,但是停药后的复发率极高[7]。以往的研究报道这两种药物的治愈率为48%~96%,但是停药后的复发率可达到49%~66%[8-10]。BV的成功治疗主要取决于BV相关致病菌的清除以及与阴道健康状态相关的乳杆菌数量的恢复[11]。以往的研究主要是观察用药几周后的菌群结构变化,但对用药后短期内的阴道菌群变化少有研究[12-14]。因此,全面了解细菌性阴道病微生物群落菌群多样性构成,分析患者在治疗前后的菌群变化对探明细菌性阴道病复发的原因及预防和治疗细菌性阴道病是必要的。本研究主要观察经甲硝唑规范治疗的细菌性阴道病患者在用药后6~8d随访时的菌群结构与治疗结局之间的关系,运用454焦磷酸测序技术和革兰染色涂片镜检相结合的方法,探讨治愈人群与治疗失败人群在用药后第6~8天这一观察点时阴道菌群多样性的差异,从而为实现改进细菌性阴道病治疗方案提供理论依据。
对象与方法
1.1研究对象选取2012年9月至2013年7月在北京大学第一医院妇科门诊诊断为细菌性阴道病的育龄期女性,规范使用甲硝唑凝胶治疗,并完成用药前、用药后6~8d、用药后1个月的随访,共61例。
1.2入组标准采用Amsel临床诊断标准[2]和Nugent实验室诊断标准[15]诊断BV。所有的分泌物涂片均由微生态实验室2名有经验的微生物专家判读。
1.3排除标准 (1)妊娠期、哺乳期和绝经期女性。(2)因其他疾病长期服用激素类药物者。(3)服用免疫抑制剂者。(4)有心、肝、肾、内分泌等内科疾病者(主要通过问诊)。(5)患有滴虫、外阴阴道白假丝酵母菌病等其它阴道感染者。(6)甲硝唑过敏者。(7)依从性差者。
1.4样本采集分别用两个无菌棉拭子从研究对象阴道侧壁上1/3处取得阴道分泌物,一个迅速放入含有1mL PBS(pH=7.4)无菌离心管中,放于-80℃超低温冰箱以便基因组提取。另一个均匀涂在载玻片上,行革兰染色,油镜下观察,进行Nugent评分。
1.5随访时间对入组的BV患者进行2次随访,分别为用药后6~8d、用药后1个月。记录患者每次就诊时的症状、体征、pH值及Nugent评分。
1.6治疗方法和治愈标准入组的BV患者使用甲硝唑凝胶(北京紫光制药有限公司,批号:
1101081,规格:5.0g),37.5mg,qd,阴道上药,连用5d。用药后6~8d和1个月分别返院随访,评价治疗效果[16-17]。治愈标准:同时满足微生态评价痊愈标准和临床评价痊愈标准为治愈。微生态评价痊愈标准:Nugent评分0~3分。临床痊愈标准:阴道分泌物性状正常,Whiff试验阴性,线索细胞消失,阴道分泌物pH值<4.5。
1.7细菌基因组DNA的分析使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN,Germany),按照Ling[18]的方法进行提取DNA。使用标准的454/RocheGS-FLX方案完成对16S rDNA V1-V3区的测序工作[19]。引物序列:上游引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,下游引物533R:5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′。对原始序列进行筛选,通过比对RDP数据库完成细菌种类的比较[20]。本文所有数据均使用SPSS15.0进行分析,数值用均数±标准差(x±s)来表示,基线数据使用x2检验和方差分析比较危险因素和细菌性阴道病的关联性。P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1一般情况本研究共有66人在用药后6~8d完成了近期疗效随访,且所有女性的Nugent评分均小于7分,即全部女性近期治疗有效。在随访期间,有4名患者感染外阴阴道白假丝酵母菌病,1名患者感染滴虫性阴道炎,其余的61名患者在用药后1个月完成了远期疗效随访,根据诊断标准共有41名BV治愈患者,20名BV复发患者,治愈率为70.50%。61名女性的平均随访时间是(31.4±7)d。为了解BV治愈人群和治疗失败人群之间阴道菌群的不同,根据第二次的随访结果,我们将人群分为治愈组和治疗失败组。
2.2革兰染色结果对甲硝唑治疗后的阴道菌群进行随访分析,第一次随访中(治疗后6~8d),阴道分泌物镜检涂片共可观察到3种情况,分别为正常菌群、菌群抑制、异常菌群。据此将所有研究对象分为3个组:其中正常菌群组(37人),菌群抑制组(14人),异常菌群组(10人)。正常菌群组主要是以革兰阳性杆菌为优势菌群(镜下判断为乳杆菌),Nugent评分为0~3分。菌群抑制组主要显示为缺乏优势菌,菌群密集度、多样性在+及以下。异常菌群组以球菌等非革兰阳性杆菌为优势菌。
2.3高通量测序454焦磷酸测序结果显示,甲硝唑治疗前后阴道菌群的多样性和丰度发生了一定程度的变化,甲硝唑并不减少阴道内乳杆菌和球菌的含量,但对BV致病菌如
Gardnerella、Atopobium、Megasphaera、Prevotella和Mobiluncus等具有明显的杀菌作用,使其数量明显减少。治疗前后的菌群种类发生变化,治疗前共发现192种细菌,以Atopobium、Prevotella、Megasphaera、Gard-nerella和Mobiluncus等BV常见菌为主要菌群。用药后6~8d共156种菌。其中,以L.iners、Enterococcus和Streptococcus这3种菌为主。而且其正常菌群组中94.59%的女性以乳杆菌为优势菌,其中86.50%的女性以L.iners为主。治疗后1个月,在治愈的女性中,97.00%的女性以乳杆菌为优势菌,其中72.70%的女性是以L.iners为主。
用药后6~8d的正常菌群组、菌群抑制组和异常菌群组的高通量测序结果显示,乳杆菌、球菌和BV相关致病菌在三组中的含量存在明显的差异。正常菌群组中以乳杆菌(94%)为优势菌;菌群抑制组中各种菌均占有一定的比例,乳杆菌(36%),球菌(57%)和BV相关致病菌(7%);菌群异常组中主要是球菌(80%)和BV相关致病菌(20%)。将用药后6~8d的镜检涂片结果和治疗结局进行比较分析,发现正常菌群组共有29人治愈,治愈率为78.40%,菌群抑制组共有8人治愈,治愈率为57.10%,异常菌群组共有4人治愈,治愈率为为40.00%,正常菌群组>菌群抑制组>异常菌群组,三组的治愈率之间差异存在统计学意义(x2=6.098,P<0.05)。
甲硝唑治疗细菌性阴道病前后阴道菌群的 结构变化及其预后相关性 
A:正常菌群,B:菌群抑制,C:菌群异常
图1 用药后6~8d革兰染色涂片镜检结果(1000×)
表1 第一次随访不同镜检结果与最终治疗结局


组别

总人数

治愈(例)

BV(+)(例)

治愈率(%)

复发率(%)

菌群抑制组

14

8

6

57.10

42.90

异常菌群组

10

4

6

40.00

60.00

正常菌群组

37

29

8

78.40

21.60

甲硝唑治疗细菌性阴道病前后阴道菌群的 结构变化及其预后相关性 
图2 用药后6~8d阴道分泌物的高通量测序结果
甲硝唑治疗细菌性阴道病前后阴道菌群的 结构变化及其预后相关性 
图3 用药后6~8d正常菌群、菌群抑制和
菌群异常状态下不同细菌的含量比例
甲硝唑治疗细菌性阴道病前后阴道菌群的 结构变化及其预后相关性 
图4 甲硝唑治疗前(A)后(B)阴道内主要菌群的含量变化
3 讨 论 
随着分子生物学技术的不断发展,尤其是高通量测序技术的应用,国内外对细菌性阴道病病因学的研究日益增多。应用分子生物学技术研究细菌性阴道病的病因、复发机制以及进行精准的诊断和治疗必将成为一种趋势。但目前国内外对细菌性阴道病患者治疗前后及复发的阴道菌群种类及数量变化研究较少,难以有效地指导临床诊断和治疗。
3.1 甲硝唑对阴道内BV相关厌氧菌的作用 甲硝唑是治疗BV的常用药,可有效缓解BV的临床症状,但停药后的复发率较高。BV的高复发率可能与阴道内病原体的持续存在、病原菌耐药以及以乳杆菌为主的阴道正常菌群的未恢复有关[21]。细菌性阴道病是一种多细菌混合感染的疾病,细菌在其生长过程中可能会产生一些耐药基因而对临床治疗产生影响。Bacteroides是BV的常见致病菌,已有研究显示Bacte-roides对甲硝唑耐药[22]。对BV相关细菌的耐药检测大多为体外实验,分离治疗前后的阴道菌群并对单菌落进行耐药性检测。Austin等人比较了用药前后细菌对甲硝唑和克林霉素的耐药情况,一共分离了865株革兰阴性菌。在用药后7~14d的分离株中,普雷沃菌(P.bivia)对克林霉素的耐药性明显增加,但只有0.3%的菌株对甲硝唑耐药[23]。Beigi等的实验与之类似,结果显示细菌对甲硝唑的耐药率低于1%[24]。本实验的高通量测序结果显示,甲硝唑对临床常见的厌氧菌的治疗效果良好。96.72%(59/61)的患者阴道内常见致病菌的比例均明显下降。本实验甲硝唑阴道用药的剂量每日使用一支甲硝唑凝胶(37.5mg,qd×5d),加大剂量每日使用两支,其甲硝唑凝胶安全性、耐受性、有效性无统计学差异[25]。并且有小样本量的体外实验也证实使用甲硝唑对BV复发患者进行再次治疗也是有效的,并且该实验也写入了2015年的美国STDs指南[26]。
3.2 甲硝唑对阴道内乳杆菌的影响 目前已证实甲硝唑在有效杀灭阴道中厌氧菌的同时对乳杆菌的影响较小。浙江大学凌宗新等通过qPCR对阴道内细菌进行定量检测,发现甲硝唑治疗BV后的第5天,部分患者阴道内的乳杆菌数量已接近正常水平,而且甲硝唑对乳杆菌还具有一定的促生长作用[27]。此外,Srinivasan等人进行了一次小样本实验,通过对使用甲硝唑凝胶治疗BV的患者用药后每天的阴道分泌物进行分析发现:在BV人群中检测到的6种BV相关菌(加德纳菌、巨球菌属、BVAB1-3、阿托波菌、动弯杆菌、纤毛菌属)随着时间推移,数量均明显减少。但3种乳杆菌(惰性乳杆菌、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌)的数量在甲硝唑治疗过程中呈增长趋势[28]。在体外实验中,Simoes等对能够分泌过氧化氢和细菌素的某种乳杆菌进行了甲硝唑肉汤微量稀释法的药物敏感性试验,结果发现当甲硝唑浓度为1000~4000mg/mL时可抑制乳杆菌(P=0.014)。当浓度≥5000mg/mL时可完全抑制乳杆菌的生长(P=0.025)。当其浓度在128~256mg/mL时则可刺激乳杆菌的生长(P=0.005),而浓度在64~128mg/mL时对乳杆菌没有任何的刺激或者抑制作用[29]。临床使用甲硝唑凝胶(37.5m)治疗BV时,血药浓度最高可达0.2μg/mL,治疗后6h阴道内的药物浓度达到最大值1000μg/mL[30],这与体外实验的结果是相符的。在这个浓度之下,乳杆菌不会受到抑制作用。本实验结果与以往的研究相符,用药后6~8d的正常菌群组,无论是镜检结果还是高通量测序结果均显示乳杆菌为优势菌群。
454焦磷酸测序结果表明,用药后6~8d和用药后1个月,正常菌群均以惰性乳杆菌(L.in-ers)为主。我们的研究结果与国外部分文献类似,Mitchell等人研究细菌性阴道病治疗后阴道内乳杆菌的定植情况,发现用药结束后患者阴道内的L.crispatus和L.jensenii所占比例较小,分别为9%(4/44)和2%(1/44),但所有人均检测到了L.iners。用药1个月后27%(12/44)的女性能够检测到L.crispatus和L.jensenii,98%(43/44)的女性可检测到L.in-ers[31]。本研究中所有女性阴道内均检测到了L.iners,在BV患者(治疗前检测)中,26.22(16/61)能够检测到L.crispatus。治疗后第一次随访时发现,虽然有63.93%(39/61)可以检测到L.crispatus,但是其中只有3个人的L.crispatus为优势乳杆菌,其他仍然是以L.ine-rs为主。而对L.iners的体外研究提示其生长特性比较特殊,产酸能力偏弱,在月经期大量增殖,需要在血琼脂平板上进行体外培养[32]。目前认为以L.iners为优势菌群的阴道环境是一种不稳定的状态,菌群结构可能会向两个方向发展:一是转变为以卷曲乳杆菌等为主的稳定健康状态,二是厌氧菌数量逐渐增长再次发展为细菌性阴道病[33]。
3.3 微生态制剂在BV治疗中的应用 本研究发现,用药后6~8d,部分人群的阴道分泌物镜检结果会出现菌群抑制状态。该状态下,镜下细菌数量明显减少,有时还会出现无菌的情况。我们推测该状态下的阴道环境是一个时间和空间的空位,如果乳杆菌不能进行及时有效的定植,致病菌则会定植并大量增殖。因此,微生态制剂在BV治疗中也可起到不可或缺的作用。目前研发的乳杆菌制剂多通过以下机制改善BV的阴道菌群环境:(1)竞争粘附阴道上皮细胞;(2)产生酸性物质维持阴道的酸性环境;(3)制造小分子物质、细菌素等直接作用于厌氧菌等[34]。
国际上已有用于治疗BV的乳杆菌制剂问世,关于益生菌制剂临床作用效果的研究也日益增加。研究发现某些患者在抗生素治疗后,应用微生态制剂进行辅助治疗可能会提高长期治愈率。Marcone等比较了甲硝唑口服组(400mg,bid×7d)与甲硝唑治疗后加用乳杆菌组(治疗后连用Lactobacillus rhamnosus胶囊7d)在治疗后3个月的治愈率,结果显示加用乳杆菌组的治愈率明显高于单用甲硝唑组,提示使用乳杆菌制剂可减少BV复发[35]。使用微生态制剂还能够起到预防BV复发的作用,对有BV复发史的女性,每日随机给予1粒含有混合微生态制剂(Lactobacillus rhamnosus,L.acidophilus,Streptococcus thermophilus)或安慰剂进行随访调查,在11个月的随访中,使用微生态制剂的一组人群其BV复发率明显降低[36]。然而,Bradshaw等在为期6个月的随访中并未发现甲硝唑与乳杆菌制剂联合使用能够降低细菌性阴道的复发率[37]。Eriksson等人使用多种乳杆菌混合的干粉制剂(L.fermentum,L.Cas-ei,L.rhamnosus,L.gasseri)联合克林霉素治疗BV,结果发现治疗组和安慰剂组的复发率之间没有统计学差异[38]。本实验的研究结果也发现,1个月后以乳杆菌为优势菌的正常菌群组,其治愈率明显高于菌群抑制组和异常菌群组。由此可见,阴道内的乳杆菌在BV治愈中发挥着重要作用,大量乳杆菌的定植有利于整个阴道微生态环境的恢复。然而,目前应用乳杆菌制剂治疗BV存在诸多争议,并且益生菌制剂的疗效也尚无定论[26]。乳杆菌制剂大部分是活菌制剂,细菌的活性、生长能力和抗菌能力等对其疗效都会产生影响。因此,益生菌制剂的研发,尤其是乳杆菌菌株的筛选将成为BV治疗领域的重要研究方向。
3.4 不足之处 本研究存在一定的局限性。首先,454焦磷酸测序技术目前只能够对菌群进行半定量分析,得出全部细菌的构成比。然而要想更好地了解健康或疾病状态下某些细菌在阴道内的变化情况,则需要对阴道菌群进行定量分析[39]。因此,在下一阶段的实验中,我们将根据高通量测序结果对部分细菌进行qPCR定量实验。其次,甲硝唑和克林霉素均为临床上用于治疗BV的常用药物[40],我们的研究结果仅限于甲硝唑治疗对阴道菌群的影响,并不一定适用于使用克林霉素的患者。另外,研究结果表明,大部分的治愈者在用药后1个月时,阴道内以惰性乳杆菌为主,而惰性乳杆菌被认为是一种阴道菌群恢复正常前的过渡状态[41]。因此在接下来的研究中,我们需要延长随访时间,以期了解BV人群经药物治疗后阴道内乳杆菌从异常状态恢复至正常稳定状态的过程。
总之,本研究通过对BV患者治疗前后的阴道分泌物进行高通量分析,总结了菌群在甲硝唑治疗前后的变化规律,揭示了药物对细菌多样性的影响。研究结果显示用药后6~8d甲硝唑能够有效地清除BV致病菌,但用药后1个月仍有18名患者复发。第一次随访(用药后6~8d)时的镜检涂片可分为三种情况:正常菌群、菌群抑制、异常菌群,而这三种不同的状态可预测1个月后的治疗结局。在实验中发现的菌群抑制现象,推测是一个时间和空间的抑菌空白状态,如果此时适当的补充合适的益生菌,可能会减少细菌性阴道病的复发。无论是治疗后第一次随访(6~8d),还是治疗后1月的随访,治愈的患者中都是以惰性乳杆菌为主要的优势菌,而这种乳杆菌仍然是不稳定的状态。我们还是应该适当的延长随访,或者使用添加一些微生态制剂,预防BV的复发。应用分子生物学方法指导临床的菌群检测工作将是未来的一个必然的发展方向,探索细菌性阴道病治疗过程中的菌群变化有助于发现复发的原因,为预防复发指明方向。
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 收稿日期:2016-02-27 修回日期:2016-03-17 本文编辑:吴英韬