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复发性外阴阴道假丝酵母菌病真菌培养及药敏情况分析

发布时间：

2017-02-09

文章编号:1005 －2216(2012)10 －0773 －04                            论 著
复发性外阴阴道假丝酵母菌病真菌培养及药敏情况分析
王恩华，刘朝晖
摘 要: 目的 探讨复发性外阴阴道假丝酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)中，白假丝酵母菌与光滑假丝酵母菌在体外对克霉唑、氟康唑、咪康唑、伊曲康唑和制霉菌素五种抗真菌药物敏感情况。方法 应用纸片扩散法，对 2006 －2012 年 1458 例 RVVC 的假丝酵母菌进行体外药物敏感试验，比较白假丝酵母菌与光滑假丝酵母菌药物敏感情况。结果 RVVC 患者中，白假丝酵母菌占 82. 1%，光滑假丝酵母菌占 16. 3%，白假丝酵母菌(99. 1%)和光滑假丝酵母菌(99. 6%)对制霉菌素的敏感率均很高;光滑假丝酵母菌对克霉唑(50. 2%)和氟康唑(74. 3%)的耐药率均高于白假丝酵母菌对克霉唑(2. 4%)和氟康唑(13. 2%)的耐药率; 白假丝酵母菌对咪康唑和伊曲康唑的耐药性和敏感性差异无统计学意义(P ＞ 0. 05)，但光滑假丝酵母菌对咪康唑的敏感性较高(58. 7%)，对伊曲康唑的耐药性较高(62. 7%)。结论 RVVC 中非白假丝酵母菌所占比例高于 VVC，光滑假丝酵母菌与白假丝酵母菌对常用的唑类抗真菌药物的药敏情况完全不同。
关键词:复发性外阴阴道假丝酵母菌病;白假丝酵母菌;光滑假丝酵母菌;药敏试验
中图分类号:R711 文献标志码:A
Investigate the pathogen flora and drug susceptibility of recurrent vulvovaginal candidiasis． WANG En-hua，LIU Zhao-hui． Department of Gynecology and Obstetrics，First Hospital of Peking University，Beijing 100034，China
Abstract:Objective To study the pathogen flora and drug susceptibility of 1458 clinical isolates of recurrent vulvovaginal candidiasis (RVVC) in vitro． Methods Neo-Sensitabs table assay was applied to study the antifungal drug susceptibility of 1458 clinical isolates to the therapy of clotrimazole，fluconazole，miconazole，itraconazole and nystatin in vitro．Results The 1458 RVVC yeast isolates were Candida albicans(n =1197，82. 1%)，Candia glabrata(n =238，16. 3%)．The drug sensitive testing shows that 99. 1% of Candida albicans and 99. 6% of Candida glabrata were sensitive to nystatin．The resistant rates of Candida glabrata isolates to clotrimaz-
ole(50. 2%) and fluconazole(74. 3%) are higher thanthose of Candida Albicans．
Conclusion Recurrent episodes are more often caused by non-albicans species．
The antifungal susceptibility between Candida albicans and candida glabrata are different．
Keywords:RVVC; candida albicans; candida glabrata; antifungal susceptibility testing
--作者单位:北京大学第一医院妇产科，北京100034通讯作者:刘朝晖，电子信箱: xyxlzh@ hotmail．com

外阴阴道假丝酵母菌 病 ( vulvovaginal candidiasis，VVC)，是一种由假丝酵母菌属引起的外阴、阴道炎症。1年内复发≥4 次称为复发性外阴阴道假丝酵母菌病(recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)。研究表明，70% ～75%的女性一生中至少患过一次 VVC，多为育龄期妇女感染。再感染率为 40% ～50%，复发率为 5% ～8% ［1］ 。近年来随着广谱抗生素、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛使用，以及工作压力大、作息不规律等导致机体长期处于亚健康状态，使 VVC 复发率不断上升，非白假丝酵母菌感染率和抗真菌药物的耐药率也呈增高趋势。因此，临床如何确定真菌感染，以及如何准确地选用抗真菌药物，成为 RVVC 治
疗的一大难点。复杂性 VVC 可为非白假丝酵母菌感染，绝大多数为光滑假丝酵母菌，宿主多为孕妇、糖尿病患者或免疫功能低下者，治疗效果差，在临床治疗上较为棘手。快速、准确地检测体外抗真菌药物敏感性，将为临床合理应用抗真菌药物提供依据。为了探讨 RVVC 中，白假丝酵母菌与光滑假丝酵母菌在体外对克霉唑、氟康唑、咪康唑、伊曲康唑和制霉菌素五种抗真菌药物敏感情况，本研究采用丹麦 ROSCO 公司生产的 Neo-Sensitabs 抗真菌药敏纸片，对临床分离的假丝酵母菌进行了体外抗真菌药物敏感性研究。
1 资料与方法
1. 1 研究对象 2006 － 2012 年我院妇产科门诊就诊的患者 1458 例中，在阴道分泌物标本中共分离到白假丝酵母菌· 3 7 7 · 中国实用妇科与产科杂志 2012 年 10 月 第 28 卷 第 10 期1197 株、光滑假丝酵母菌238 株、克柔假丝酵母菌17 株、热带假丝酵母菌 2 株及非常见典型假丝酵母菌 4 株。标准菌株:白假丝酵母菌 ATCC 96113(北京大学第一医院妇产科微生态实验室提供)。
1. 2 研究材料 科玛嘉显色培养基(郑州博赛生物公司)、M-H 琼脂平板(英国 oxoid 公司)，ROSCO 药敏纸片:克霉唑、氟康唑、咪康唑、伊曲康唑、制霉菌素。
1. 3 研究方法
1. 3. 1 假丝酵母菌分离鉴定 采用文献［2］科玛嘉显色培养基(Chrom Agar)对临床分离的假丝酵母菌进行鉴定，用无菌接种环接种于平板上，置于 36 ℃温箱，培养 24 ～48h。
1. 3. 2 假丝酵母菌药敏试验 采用 ROSCO 纸片法。(1)制备假丝酵母菌悬液:挑取 3 ～5 个菌落至 2 mL 0. 85% 无菌生理盐水中，旋摇成均匀的菌悬液，用无菌盐水调整比浊至 0. 5 麦氏标准浊度菌悬液，假丝酵母菌量约为(1 ～5) ×10 6 菌细胞/mL。(2)接种假丝酵母菌:用无菌酵母菌液浸湿无菌棉拭子后，在管内壁液面上方旋转挤压，挤去多余菌液。在琼脂表面轻柔、均匀涂布接种 3 次，每次旋转平板60°以确保接种菌的均匀分布，最后沿平板内缘涂抹 1 周。
(3)贴纸片:待琼脂吸收假丝酵母菌液 15 min 后，用无菌镊在已接种假丝酵母菌液的平板上贴 5 种药敏纸片，每种 1张，轻压，使纸片与琼脂表面完全接触。(4)培养:将平板置于 37 ℃温箱，18 ～24 h 后读取结果，若 24 h 生长不良，
可延长至 48 h。(5)结果判定:培养后取出平板，测量抑菌环的直径。遵照 ROSCO 真菌药敏片的基本抑菌圈判读标准判定(见表 1)，其中“中介”指介于“敏感”和“耐药”之间，对抗真菌药物治疗可能低于敏感株高于耐药株，相当于缓冲区域。
表 1 假丝酵母菌纸片扩散法敏感试验判断标准


抗真菌药物

药片剂量(μg)

抑菌环直径(mm)

敏感

中介

耐药

克霉唑

10

≥20

12 ～19

≤11

氟康唑

15

≥20

12 ～19

≤11

咪康唑

10

≥20

12 ～19

≤11

伊曲康唑

8

≥15

10 ～14

≤9

制霉菌素

50

≥15

10 ～14

≤9

1. 3. 3 统计学分析 采用 SPSS 19. 0 软件对数据进行统计分析。白色假丝酵母菌与光滑假丝酵母菌药敏情况分析使用 Friedman M 秩和检验。
2 结果
2. 1 分离菌株构成比 本组 1458 株假丝酵母菌中(表2)，1197 株(82. 1%)白假丝酵母菌，238 株(16. 3%)光滑假丝 酵 母 菌，17 株 (1. 17%) 克 柔 假 丝 酵 母 菌，2 株(0. 14%)热带假丝酵母菌，4 株(0. 27%)非常见典型假丝酵母菌。由于光滑假丝酵母菌占非白假丝酵母菌 91. 2%，因此，本文只讨论白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌对五种抗真菌药物的敏感情况。收集样本的过程中，药敏试验所
用的纸片出现断货现象，所以药敏试验存在少量缺失，但不影响统计学结果，见表 2。
表 2 白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌的样本情况(株


菌株

克霉唑

氟康唑

咪康唑

伊曲康唑

制霉菌素

白假丝酵母菌

 

 

 

 

 

有效

1132

1179

1179

1150

1192

缺失

65

18

18

47

5

光滑假丝酵母菌

 

 

 

 

 

有效

215

230

235

233

234

缺失

23

8

3

5

4

有效总计

1347

1409

1414

1383

1426

2. 2 同一种假丝酵母菌对不同抗真菌药物的耐药率差异
2. 2. 1 白假丝酵母菌 五种抗真菌药物中，对白假丝酵母菌耐药率最低的是制霉菌素 (0. 3%)，其次是克霉唑(2. 4%)、氟康唑(13. 8%)。白假丝酵母菌对咪康唑和伊曲康唑均表现出较高的耐药性，耐药率分别为 51. 0% 和48. 3%。
2. 2. 2 光滑假丝酵母菌 光滑假丝酵母菌表现出对制霉菌素很低的耐药率(0.4%)，而对于其他 4 种抗真菌药物，光滑假丝酵母菌的药敏结果完全不同于白假丝酵母菌(见表 3)。光滑假丝酵母菌对克霉唑的耐药率为 49. 8%，氟康唑的耐药率为 74. 3%，咪康唑的耐药率为 22. 6%，伊曲康唑的耐药率为 62. 7%，均高于白假丝酵母菌。
表 3 同一种假丝酵母菌对不同抗真菌药物的敏感性差异［株(%)］


菌种    

 

克霉唑

氟康唑

 咪康唑

伊曲康唑

制霉菌素

白假丝酵母菌

敏感(S)

1044(92. 2)    

892(75. 7)

501(42. 5)

572(49. 7)

1181(99. 1)

 

耐药(R)

27(2. 4)

163(13. 8)

 601(51. 0)

553(48. 6)

3(0. 3)

光滑假丝酵母菌

敏感(S)

36(16. 7)   

20(8. 7)

 138(58. 7)

85(36. 5)

233(99. 6)

 

耐药(R)

108(50. 2)

171(74. 3)

 53(22. 6)

146(62. 7)

1(0. 4)

P

 

＜0. 05

＜0. 05

＜0. 05

＜0. 05

＜0. 05

注::统计学方法采用 Friedman M 秩和检验
2. 3 白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌对同一种抗真菌药物的敏感性
2. 3. 1 克霉唑 1197 株白假丝酵母菌中，共有 1132 株进行了克霉唑药物敏感试验 ( 见表 4)，其中有 1044 株(92. 2%)对克霉唑敏感;耐药株数只有 27 株(2. 4%)，即绝大多数白假丝酵母菌均对克霉唑敏感。不同的是，在215 株进行克霉唑试验的光滑假丝酵母菌中，有 36 株(16. 7%)对克霉唑敏感，108 株(50. 2%)对克霉唑耐药，即半数光滑假丝酵母菌对克霉唑耐药。2. 3. 2 氟康唑 1179 株白假丝酵母菌和 230 株光滑假丝酵母菌进行了氟康唑药物敏感试验(见表 5)，其中有 892株(75. 7%)对克霉唑敏感;耐药株为 163 株(13. 8%)。在230 株光滑假丝酵母菌中，只有 20 株(8. 7%)对氟康唑敏感，181 株(74. 3%)对氟康唑耐药。
2. 3. 3 咪康唑 1179 株白假丝酵母菌中，共有 501 株(42. 5%)对咪康唑敏感，601 株(51. 0%)对咪康唑耐药;而在 235 株光滑假丝酵母菌中，138 株(58. 7%)对咪康唑的敏感，53 株(22. 6%)对咪康唑耐药，同时，44 株(18. 7%)光滑假丝酵母菌对咪康唑存在剂量依赖性(见表 6)。
2. 3. 4 伊曲康唑 1150 株白假丝酵母菌中，共有 572 株(49. 7%)对伊曲康唑敏感，556 株(48. 3%)对伊曲康唑耐药;而在 233 株光滑假丝酵母菌中，85 株(36. 5%)对伊曲康唑敏感，146 株(62. 7%)耐药(见表 7)。
2. 3. 5 制霉菌素 1192 株白假丝酵母菌和 234 株光滑假丝酵母菌对制霉菌素均表现出很高的敏感性，分别是99. 1%和 99. 6%(见表 8)。
表 4 白假 丝酵母菌和光滑假丝酵母菌对克霉唑药物敏感性比较 
                          敏感［株(%)］ 中介［株(%)］ 耐药［株(%)］ 总计(株)
白假丝酵母菌            1044(92. 2)     61(5. 4)        27(2. 4)       1132
  光滑假丝酵母菌           36(16. 7)       71(33. 0)       108(50. 2)     215
      总计                 1080(80. 2)     132(9. 8)       135(10. 0)     1347
注:白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌对克霉唑药物敏感性比较，差异有统计学意义(P ＜0. 01)

表 5 白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌对氟康唑药物敏感性比较                             
敏感［株(%)］ 中介［株(%)］ 耐药［株(%)］ 总计(株)
   白假丝酵母菌            892(75. 7)      124(10. 5)      163(13. 8)     1179
  光滑假丝酵母菌           20(8. 7)        39(17. 0)       171(74. 3)     230
      总计                 912(64. 7)      163(11. 6)      334(23. 7)     1409
注:白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌对氟康唑药物敏感性比较，差异有统计学意义(P ＜0. 05)

表 6 白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌对咪康唑药物敏感性比较                            
                     敏感［株(%)］ 中介［株(%)］ 耐药［株(%)］ 总计(株)
   白假丝酵母菌            501(42. 5)      77(6. 5)        601(51. 0)     1179
  光滑假丝酵母菌           138(58. 7)      44(18. 7)       53(22. 6)      235
      总计                 639(45. 2)      121(8. 5)       654(46. 3)     1414
注:白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌对咪康唑药物敏感性比较，差异有统计学意义(P ＜0. 05)

表 7 白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌对伊曲康唑药物敏感性比较                            
                     敏感［株(%)］ 中介［株(%)］ 耐药［株(%)］ 总计(株)
   白假丝酵母菌            572(49. 7)      22(1. 9)        556(48. 3)     1150
  光滑假丝酵母菌           85(36. 5)       2(0. 9)         146(62. 7)     233
      总计                 657(47. 5)      24(2. 0)        702(50. 5)     1383
注:白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌对伊曲康唑药物敏感性比较，差异有统计学意义(P ＜0. 05)

表 8 白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌对制霉菌素药物敏感性比较                            
                     敏感［株(%)］ 中介［株(%)］ 耐药［株(%)］ 总计(株)
   白假丝酵母菌            1181(99. 1)     8(0. 7)         3(0. 3)        1192
  光滑假丝酵母菌           233(99. 6)      0(0. 0)         1(0. 4)        234
      总计                 1414(99. 2)     8(0. 7)         4(0. 3)        1426
注:白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌对制霉菌素药物敏感性比较，差异无统计学意义(P ＞0. 05)
3 讨论
很多研究表明，非白假丝酵母菌感染的比例上升给复发性外阴阴道假丝酵母菌病(RVVC)的临床治疗带来很大困难［3-5］ ，Richter 等研究发现，RVVC 患者中非白假丝酵母菌所占比例竟高达 42%。真菌药敏试验不仅可以监测真菌耐药趋势，为临床选择敏感的抗真菌药物，还能有助于临床真菌感染的管理，因此，需要快速、准确的抗真菌药敏试验为临床治疗提供依据。
本研究从 1458 例RVVC 患者阴道分泌物分离的假丝酵母菌中，主要致病菌为白假丝酵母菌(82. 1%)，非白假丝酵母菌占 17. 9%，光滑假丝酵母菌在非白假丝酵母菌中占绝大多数，这与国外报道［6-7］ 不尽相同。在刘朝晖等 ［8］对北京 8 家医院 VVC 患者的致病菌研究显示，非白假丝酵母菌只占 7%，提示，RVVC 难治性与高复发率可能与非白假丝酵母菌感染有关。白假丝酵母菌和光滑假丝酵母菌对制霉菌素均表现出很高的敏感性，符合之前的报道 ［9-10］，但
对于唑类药物，两种假丝酵母菌的药敏结果不尽相同。Richter 等［11］ 从 VVC 患者阴道分泌物分离的假丝酵母菌中，3. 7%对氟康唑耐药，16. 2%对伊曲康唑耐药，而光滑白假丝酵母菌中，15. 2%对氟康唑耐药，明显低于本组试验结果。此外，刘朝晖等［8］ 研究结果显示，0. 9%对克霉唑耐药，2. 6%对氟康唑耐药，27. 8% 对咪康唑耐药，49. 8% 对伊曲康唑耐药，78. 4%对制霉菌素耐药，与本组 RVVC 患者结果相比，克霉唑、氟康唑、咪康唑耐药率均低于本组，提示随着抗真菌药物的广泛应用，真菌耐药率不断升高，可能是引起复发性外阴阴道假丝酵母菌病(RVVC)难治与反复发作的一个重要原因，本试验结果进一步证实 RVVC 对唑类药物的耐药率明显高于 VVC。因此，建议常规对 RVVC 患者进行致病菌检查和体外药敏试验，根据致病菌种类和药敏结果，合理选择抗真菌药物。
体外药敏结果中，“中介”处于“敏感”和“耐药”之间，其作为一个缓冲域，用来防止由微小试验误差可能造成错误结果，与敏感株相比，用该药治疗效果不好，但如果加大临床用药量、延长用药时间，可能有效。本试验结果中克霉
唑、咪康唑和氟康唑作用于光滑假丝酵母菌的中介状态的例数明显高于白假丝酵母菌的例数，这一点可能是非白假丝酵母菌引起 RVVC 的难治原因之一，对于此类患者，可以适量加大用药量、延长用药时间。
Gharuoum 等［12］ 报道，应用 CLSI 推荐的标准化方法(NCCLS M27-A)检测抗真菌药物敏感性结果与临床应用效果的一致性可达 66. 0% ～ 85. 0%，但该方法操作较为繁琐，很难在临床上推广。郭毅等［13］ 研究表明，与 CLSI 酵母菌纸片扩散法(NCCLS M44-P)相比，丹麦 ROSCO Neo-Sen-sitabs 酵母菌药片扩散法操作简便，适合常规实验室开展，其药敏基本判读标准适合我国临床菌株，结果判读准确，但由于部分药物抑菌圈小，难以鉴别敏感和耐药，与标准稀释
法结果比较，变异系数较大，由于此方法是基于体外的药敏试验，对临床用药指导存在一定局限性。
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(2012 －02 －16 收稿 2012 －06 －25 修回)

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