蔗糖凝胶治疗细菌性阴道病的多中心、随机、双盲、平行对照Ⅲ期临床试验

蔗糖凝胶治疗细菌性阴道病的多中心、随机、双盲、平行对照Ⅲ期临床试验
肖冰冰1 张岱1 陈锐1，2,史惠蓉3,辛晓燕4,王惠兰5,庞义6 朱赛楠7,姚 晨7,廖秦平1,2△  
(1.北京大学第一医院妇产科，北京100034; 2.北京清华长庚医院，北京100044 ; 3.郑州大学第一附属医院妇产科，郑州450052; 4.第四军医大学西京医院妇产科，西安710032; 5.河北医科大学第二医院妇产科，石家庄 050000; 6.河北医科大学第三医院妇产科，石家庄050051; 7.北京大学第一医院医学统计室，北京100034)
[摘 要]目的：通过多中心、随机、双盲、平行对照的临床研究，进一步评价蔗糖凝胶治疗细菌性阴道病的有效性及安全性。方法：选择5个研究中心的533例细菌性阴道病患者作为研究对象，依据随机表按对照组与试验组为 2:3比例随机人组，甲硝唑凝胶5.0 g组（对照组)214例，蔗糖凝胶5. 0 g组（实验组）319例，两组均采取每日早晚各一次阴道上药，连用5 d的疗程进行治疗。分别于治疗第7 - 10天、第21 - 30天进行疗效观察及安全性评价。 结果：治疗第7 -10天，甲硝唑凝胶组和蔗糖凝胶组的临床综合疗效治愈率分别为70.53%和80. 83%，阴道分泌物涂片Nugent积分痊愈率分别为71.50%和81.15%，差异均有统计学意义（P<0. 05)。治疗第21-30天，甲硝唑凝胶组和蔗糖凝胶组的临床综合疗效治愈率分别为63.29%和61.98%，差异无统计学意义（P> 0. 05 )。结论：蔗糖凝胶治疗细菌性阴道病的临床综合疗效近期（治疗第7-10天)及恢复阴道菌群方面明显优于甲硝唑凝胶，远期治愈率(治疗第21-30天）与甲硝唑凝胶相当，可成为治疗细菌性阴道病的新策略。
[关键词]阴道病，细菌性;投药，阴道内;蔗糖;临床试验，Ⅲ期
[中图分类号]R711.73  [文献标志码]A     [文章编号]1671-167X(2015)06(925(8
doi：10.3969/j.issn. 1671-167X. 2015.06.007
细菌性阴道病（bacteral vaginosis，BV)是育龄期女性常见的下生殖道感染性疾病，是由于正常阴道微生态菌群构成发生变化，即维持正常阴道酸性环境的优势菌乳酸杆菌减少，而其他多种微生物 (主要为厌氧菌）増多所导致的无阴道黏膜炎症表现的临床综合征[1]。细菌性阴道病与宫颈炎、盆腔炎、不孕症、异位妊娠、性传播感染等的发生相关，妊娠期可增加自然流产、早产、胎膜早破、绒毛膜羊膜炎、新生儿感染等并发症，严重影响了女性生殖健康[2]。近年研究发现，细菌性阴道病的复发和持续感染会增加发生宫颈癌和感染人类免疫缺陷病毒
(human immunodeficiency vims，HIV)的风险[3-4 ]，目前临床应用甲硝唑和克林霉素按标准方案治疗BV，3个月内复发率高达30%，1年内复发率超过50%[5-6]，因此，需要探索一种新的治疗方法来替代或补充目前的抗生素治疗，应用微生态调节剂日益成为后抗生素时代治疗BV、预防BV复发的新方向。本临床试验研究药物—蔗糖凝胶（批件号:2003L01824)是以蔗糖为有效成分、黄原胶为赋形剂制备而成，是一种新的微生态益生元制剂，本研究采用多中心、随机、双盲、平行对照的临床试验研究方法，进一步评价蔗糖凝胶治疗细菌性阴道病的有效性及安全性，为今后临床应用提供依据。
1 资料与方法
1.1研究对象
选择2011年3月至11月在北京大学第一医院、郑州大学第一附属医院、第四军医大学西京医院、河北医科大学第二医院、河北医科大学第三医院5个试验中心就诊，符合细菌性阴道病诊断的女性患者533例，完成试验515例，各治疗组未完成病例差异无统计学意义。
所有参与研究的受试者均自愿同意参加此临床试验，并签署书面知情同意书。本临床试验研究方案已经获得北京大学第一医院伦理委员会审核批准，伦理审查批件号:北京大学第一医院伦理委员会 (2011)药物注册第（04)号。
1.1.1入选标准
(1)同时符合以下四项经Amsel临床诊断标准确诊为细菌性阴道病的患者:①阴道分泌物增多，变稀、均质状、灰白色，可伴有分泌物异味、外阴瘙痒或烧灼感;②阴道分泌物pH>4.5;③阴道分泌物胺试验（Whiff test)阳性；④线索细胞（clue cell)阳性。 (2)阴道分泌物清洁度I～Ⅱ度。（3)阴道分泌物革兰染色积分法评分（Nugent评分）≥7。（4)18 - 50岁，有性生活史，未绝经的女性。（5)签署知情同意书自愿受试。
1.1.2排除标准
(1)患有其他感染原因造成的外阴阴道炎如外阴阴道假丝酵母菌病、滴虫性阴道炎、疑似淋病、 单纯性疱疹病毒感染和尖锐湿疣等疾病者;(2)入组前两周内接受了全身性或阴道抗真菌/抗生素治疗；（3)怀孕（必要时测定血HCG判断）或哺乳期妇女；（4)肝肾功能不全、血液病、精神病或患有其他严重疾病的妇女；（5)甲硝唑过敏者；(6)依从性差者。
1.1.3脱落标准
所有签署了知情同意书并经筛选合格进入试验的受试者，均有权随时退出临床试验，无论何时何因退出，只要没有完成临床试验全程观察，均为脱落病例。签署知情同意书的合格受试者，未使用试验药物而出现月经者，可在月经后进行妇科检查和阴道分泌物的实验室复查，符合入组标准参加试验并完成临床试验全程观察者，不判定为脱落病例。
1.2研究方法
1.2.1样本量、随机化、盲法
根据前期临床研究结果，甲硝唑凝胶组7d的临床治愈率为72%，蔗糖凝胶组为82%，采用优效性检验，界值为0.01%，单侧检验水准为0.025，把握度74%，试验组与对照组比例为3: 2，根据PASS2008估计所需样本量为试验组与对照组样本量分别应为300和200例，为防止试验过程中出现病例脱落情况，每组病例增加10%，即试验组330例，对照组220例。
本研究为双盲研究，由北京大学第一医院统计室工作人员用SAS8.0版统计软件包产生随机数字并进行编盲，在数据锁定后进行第一次揭盲，统计分析报告完成后进行第二次揭盲。本次临床研究有5个研究单位参加，550例病例随机分入试验组和对照组。

1. 2研究用药

试验药:蔗糖凝胶剂，批号101101，规格5.0g，有效期至2012年10月，药物来源为河北医科大学生物医学工程中心。
阳性对照药:甲硝唑阴道凝胶剂，批号为1101081，规格5.0g，有效期至2012年6月16日，药物来源为北京紫光制药有限公司。

1. 3给药方案及确定依据

结合蔗糖凝胶Ⅱ期临床试验结果，本次试验药物蔗糖凝胶的剂量设定为5.0g，平行对照拟 采用阳性药物对照，为美国食品和药物管理局 (food and drugadministration，FDA )推荐治疗细 菌性阴道病常规用药一甲硝唑凝胶。根据蔗糖凝胶Ⅱ期临床试验结果和甲硝唑阴道凝胶剂使用说明书，试验药物和阳性对照药物均采用阴道内给药，5.0g/次，每日早晚各1次，疗程5d的 药 。
1.2.4 随访
1 2.4.1 随访时间 第1次随访为用药开始第3-4天;第2次随访为用药开始第7-10天;第3次随访为用药开始第21-30天。
1.2.4.2 随访观察指标 第1次随访：电话询问用药后的一般情况及症状并记录不良事件。第2 次随访:详细询问用药后的一般情况及症状，再次进行常规妇科检查和临床有效性指标（分泌物性状、Whiff试验、线索细胞、分泌物PH值测定）与阴道分泌物Nugent评分的检查，同时进行肝功能、肾功能、血尿常规、空腹血糖、心电图等安全性指标检查，记录合并用药与不良事件，填写病例报告表 (case report form，CRF)。第3次随访:详细询问一般情况及症状，进行常规妇科检查、白带常规检查、Whiff试验、线索细胞检查、分泌物pH测定、阴道分泌物Nugent评分，记录合并用药与不良事件并填写CRF表。

1. 5疗效评价

1.2.5.1 主要疗效指标 临床综合疗效评价有效性（治疗第7-10天），评定标准要求同时满足Nugent评分痒愈标准和临床评价痊愈标准为治愈，否则为无效。（1) Nugent评分标准:痊愈:Nugent评分 0-3 分;无效：Nugent 评分 4-10 分。（2) Amsel 临床评价标准：临床痊愈:需同时满足分泌物性状正常、Whiff试验阴性、线索细胞消失和分泌物pH值≤4.5这4个条件。临床无效:不满足临床痊愈的标准或在试验期间加用了抗生素治疗BV或研究者认为在试验期间需要加用辅助药物治疗BV。
1.2.5. 2 次要疗效指标 治疗第21-30天临床疗、 阴道 Nugent总积分和Amsel分析各单项指标。
1.2.6  安全性评价
在第2次随访时进行肝、肾功能，血、尿常规，空腹血糖，心电图等安全性指标检查，随时记录不良事件发生日期、程度及其处置方法、转归等，并判断与药物的关系。
1.3统计学分析
使用SAS8.0统计软件进行分析。
有效性指标采用全分析集（full analysis set， FAS)和符合方案集（pre-protoccl，PP)进行分析，安全性指标采用安全性人群（safety)进行分析。（1)全分析人群:尽可能按意向性治疗原则的理想的病例集，由所有随机化的受试者中排除了最少和不合理的病例而得到，对于未能进行末次疗效评价的病例资料，将采用末次观测向前结转（last observation ccrried forward，L0CF)的方法进行缺失值补充;（2)符合方案人群:又称有效病例、有效样本、可评价病例样本，由充分依从于实验方案以保证这些数据会按所基于的科学模型而表现治疗效果的病例子集所产生的数据集;（3)安全性人群:所有随机化后至少接受一次的受试者。
定量指标的描述将计算均数、标准差、中位数、最小值、最大值，分类和等级指标的描述用各类的例数及分数。主用指标采用中心分层因素CMH(cochran-mantel-haenszel)卡方检验，并计算被比较组间的率差的95%可信区间。计量资料的组间比较采用成组t检验或Wilcoxon秩和检验，计数资料的组间比较采用卡方检验或精确概率检验，等级资料组间比较采用Wilcoxon秩和检验。一般的统计检验采用双侧检验，P<0. 05认为差异有统计意义，主要疗效指根据95%可信区间下限是否超过优效界值判断是否为优效。
2结果
2.1 入组和完成情况
本研究共入组533例病例，其中520例进入FAS和PP人群，523例进入安全性分析人群（图 1)。完成试验515例，试验期间脱落18例，其中16例为失，1例为受者在内，1例为第2次随访出现月经，不能进行疗效评定。
 
图1人群分布图
Figure 1 the distribution map of population in the study
2.2受试者人口学、基线情况及可比性分析
采用成组t检验对两组间的年龄、身高、体重、血压、脉搏等进行，除平均年龄两组比较差异有 统计学意义（P=0.049)外，其他各指标比较差异均无统计学意义（P>0.05)。应用卡方检 验对病史中的是否重复治疗、是否绝经1年上、是否采取避孕措施、避孕工具、既往史、治疗史、过敏史和用药史进行基线比较，差异均无统计学意义（P>0.05)。对FAS人群阴道分泌物Nugent 评分、临床检查中的分泌物性状检查、Whiff试验、线索细胞和pH值测定检查进行组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。两组病例具有良好的均衡可比性。
2.3 主要疗效分析
第7〜10，在FAS人群甲硝唑凝胶组和蔗糖凝胶组的临床综合疗效治愈率分别为70.53%
和80.83%，两组CMH卡方检验P=0.007(表1 )，治愈率差值（试验组-对照组）95%可信区间在FAS人群和PPS人群均为2.72%〜17.89%，蔗糖凝胶组优于甲硝唑凝胶组，PP人群结果和FAS人群果一致。
2.4 次要疗效分析
2.4.1 治疗第21〜30天临床综合疗效
FAS人群甲凝胶组和蔗糖凝胶组的临床综和疗效治愈率分别为63.29%和61.98%，PP人
群治愈率分别为63.59%和61.81%，两组率差CMH卡方检验差异无统计学意义P>0.05,表2)。

表1各中心治疗第7-10天临床综合疗效结果
Table 1 The cure rate among BV patients treated  with sucrose  gel  and metronidazole gel (based on the microbiologic and clinical cure rates) at 7-10 days after treatment from all centers(n%)

*Average score( one-dimensional order).

表2各中心治疗第21~30天临床综合疗效结果
Table 2 The cure rate among BV patients treated wth sucrose gel and
metronidazole gel (based on the microbiologic and clinical cure rates)  at 21-30 days after treatment from all centers  n(%)

*Average score! one-dimensional order).
2.4.2  阴道分泌物涂片Nugent总积分疗效
治疗第7 -10天，阴道分泌物涂片Nugent积分甲硝唑凝胶组和蔗糖凝胶组在FAS人群痊愈率分别为71.50%和81.15%，两组CMH卡方检验P< 0.05(P = 0.010，表3 )，蔗糖凝胶组优于甲硝唑凝胶组，PP人群结果和FAS人群结果一致。
治疗第21 - 30天，阴道分泌物涂片Nugent积分甲硝唑凝胶组和蔗糖凝胶组在FAS人群痊愈率分别为64.73%和30%，两组CMH卡方检验P> 0.05 (P = 0.578，表4 )，在PP人群痊愈率分别为65.05%和62.14%，两组CMH卡方检验P> 0.05 (P=0.682)。
2. 4. 3  Amsel临床疗效分析
治疗第7-10天，在FAS人群甲硝唑凝胶和蔗糖凝胶痊愈率分别为83.57%和81.15%，两组CMH卡方检验P=0.479(表5)，PP人群结果和FAS人群结果一致。
治疗第21 - 30天，在FAS人群甲硝唑凝胶和蔗糖凝胶痊愈率分别为66.18%和61.98%，在PP人群痊愈率分别为66.02%和61.81%，两组CMH卡方检验P>0.05(表6)。
表3各中心治疗第7〜10天Nugent总积分痊愈率结果
Table 3 The recovery rate of Nugent score among BVpatients treated with sucrose gel and metronidazole gel at 7 to 10 days after treatment from all centers  n(% )

*Average ecore( one-dimensional order).

表4各中心治疗第21〜30天Nugent总积分痊愈率结果
Table 4 The recovery rate of Nugent score among BV pHient；reated witli sucrose gel and metronidazole gel at 21 -30 days after treatment from all centers n(%)

*Average score(one-dimensional order).
2.5 安全性分析
实验室检查:血常规血红蛋白治疗前后有临床意义变化1例（蔗糖凝胶组，治疗前101 g/L,治疗后 102 g/L),尿常规白细胞项治疗前后有临床意义变化 3例(廉糖凝胶组2例，甲硝唑组1例，复查均正常），心电图治疗前后有临床意义变化1例（甲硝唑组）。
白带常规:治疗第7 - 10天，念珠菌感染4例 (甲硝唑组2例，蔗糖凝胶组2例，清洁度异常者 (Ⅲ度）甲硝唑组与蔗糖凝胶组各1例。治疗第 21 ~ 30天，念珠菌感染6例（甲硝唑组），清洁度异常者（Ⅲ度）甲硝唑组2例。

表5各中心治疗第7〜10天临床疗效结果
Table 5 The cure rate among BV patients treated witli sucrose gel and
metronidazole gel ! based on the clinical efficacy) at 7 - 10 days after treatment from all centers  n(%)

*Average score(one-dimensional order).
不良事件:本研究安全人群中，未出现严重不良事件，未出现因不良事件而导致脱落的情况。全部不良事件发生率甲硝唑组为11.59%，蔗糖凝胶组为 6.65%。
相关不良事件:与药物相关的不良事件全部为轻度不良事件，未导致药物使用剂量改变。相关不良事件总发生率甲硝唑组为8.70%，蔗糖凝胶组为4.75%。胃肠系统异常（便秘、腹痛、腹胀）甲硝唑组发生率为2.42%，蔗糖凝胶组为3.48% ;女性生殖系统异常（念珠菌感染、外阴阴道烧灼感、外阴瘙痒）甲硝唑组发生率为5.80%，蔗糖凝胶组为0.95% ;全身性异常（腰背痛、腰酸）甲硝唑组发生率为0.97%，蔗糖凝胶组为0.95%。
表6各中心治疗第21〜30天临床疗效结果
Table 6 The cure rate among BV patients treated witli sucrose gel and metronidazole gel ! based on the clinical efficacy) at 21 - 30 days after treatment from all centers   n(%)

*Average score( one-dimensional order).

3讨论
3.1 蔗糖凝胶治疗细菌性阴道病的疗效分析
    目前应用微生态制剂治疗BV仍处在探索阶段，本临床研究中临床疗效判定标准借鉴了 FDA在抗生素治疗BV的标准[7]，主要观察点则结合蔗糖凝胶的作用特点设定为治疗第7-10天，以期客观、科学地评价蔗糖凝胶有效性。
    本次试验结果显示，治疗第7 -10天，蔗糖凝胶组的临床综合疗效治愈率、阴道分泌物Nugent积分痊愈率、乳杆菌评分均优于甲硝唑凝胶组。这充分体现了作用机制不同的两种药物在对阴道菌群的改变方面的作用不同，蔗糖凝胶更利于乳杆菌恢复为阴道优势菌群，而甲硝唑凝胶在抑制致病菌方面作用更加突出。蔗糖凝胶不同于临床上常用的抗菌素类制剂一甲硝唑凝胶，它是以单一的小分子化合物寡糖—蔗糖为有效成分。前期的基础试验及动物试验模型研究已证实其具有选择性地促进阴道内乳杆菌生长的作用，使乳杆菌分解糖原产生乳酸，从而降低阴道pH值，同时诱导乳杆菌分泌过氧化氢和细菌素，抑制致病菌的生长，使细菌性阴道病样菌群转变为乳杆菌优势菌群【8】。它的治疗机制完全不同于临床上常用的抗菌素类制剂，不会发生抗菌素治疗过程中由于菌群抑制而出现的阴道菌群空白期的现象。因此，蔗糖凝胶在迅速恢复BV患者阴道正常菌群方面比抗菌素更具有优势。此外，Amsel临床疗效痊愈率甲硝唑凝胶组与蔗糖凝胶组均分别为83. 57%和 81.15%，两组差异无统计学意义（P>0.05)，由于Amsel诊断标准，主要用于评价患者的临床症状改善情况，说明两者在症状改善方面作用相当。
    关于甲硝唑凝胶和蔗糖凝胶治疗细菌性阴道病的远期治愈率评价，本次试验结果显亦，在治疗第 21-30天，甲硝唑凝胶组和蔗糖凝胶组的临床综合疗效治愈率相当，差异无统计学意义，但均比治疗第7 -10天有所下降。Schwebke等[9]曾报道延长甲硝唑用药时间为第7-14天可提高BV的治愈率。因此，在今后的临床研究中可以对是否延长蔗糖凝胶的用药时间以提高远期治愈率进行进一步探讨。
3.2  蔗糖凝胶治疗细菌性阴道病的安全性分析
    蔗糖凝胶Ⅱ期临床试验研究中已证实其治疗细菌性阴道病的安全性[8]，本次试验通过扩大样本量，增加阳性对照药物，再次对该药物的安全性进行评估。
    本研究安全性人群中未出现严重不良事件，未出现因不良事件而导致脱落的情况。与药物相关的不良事件全部为轻度不良事件，未导致药物使用剂量改变。念珠菌感染在两组治疗后仍较常见，但甲硝唑凝胶组发生率为5.80%，而蔗糖凝胶组仅为 0.95%。有文献报道甲硝唑凝胶治疗BV后继发念珠菌感染的发生率约为6.0% - 30.0% [10]，主要是 由于抗菌素治疗破坏了阴道菌群的平衡，造成阴道菌群的空白期，从而造成隐性携带的念珠菌大量增殖或造成外源念珠菌的定植感染。研究显示，阴道乳杆菌的存在对念珠菌的增殖有一定程度的抑制作用，已完成的临床研究中蔗糖凝胶组念珠菌感染发生率低于甲硝唑凝胶组[8]，说明蔗糖凝胶对于恢复阴道微生态平衡，减少继发感染存在优势。
3.3  蔗糖凝胶为细菌性阴道病的药物治疗提供了新的方向
    目前临床应用甲硝唑和克林霉素按标准方案治疗BV，3个月内复发率高达30%，1年内复发率超过50%【5-6】。近年来，国外已有许多学者报道应用微生态调节剂治疗BV【11-21】。微生态调节剂是在微生态学理论指导下，调整微生态，保持微生态平衡， 提高宿主（动物、植物和人)健康水平或增进健康状态的益生菌（微生物）及其代谢产物和生长促进物质（益生元）的制品。目前国内仅有一种益生菌制剂一阴道用乳杆菌活菌胶囊应用于临床。中国临床妇产科医生和微生态科研人员希望有更多本国生产的阴道益生菌或益生元产品上市。蔗糖凝胶是以单一的小分子化合物寡糖一蔗糖为有效成分、黄原胶为赋形剂制备而成，主要成分为蔗糖，只能被少数细菌分解，因此具有选择性地促进阴道内乳杆菌生长的作用。我们前期的基础研究结果显示，蔗糖凝胶通过促进阴道内固有有益乳杆菌的增值，增强阴道酸度，调节阴道菌群，抑制、清除阴道有害菌，能够达到治愈bv的效果。同时通过Ⅱ期临床试验对治疗BV的用药剂量与用药频次进行了探索，证实了蔗糖凝胶5.0g每日2次、连续用药5天的治疗方案可有效治疗BV[8]。本次研究结果显示蔗糖凝胶治疗细菌性阴道病的临床综合疗效近期（治疗第7-10天)优于甲硝唑凝胶，远期治愈率（治疗第 21-30天）与甲硝唑凝胶相当，且在恢复患者阴道菌群方面明显优于甲硝唑凝胶，因此，本研究为细菌性阴道的药物治疗提供了新的策略 。
    综上所述，随着人们对细菌性阴道病研究的逐步深入，对其治疗的认识也从单纯临床症状的改善逐步过度到强调阴道微生态菌群的全面恢复和平衡。作为国家一类化学新药，也是我国研发的第一种用于治疗阴道感染的益生元类微生态调节剂，蔗糖凝胶的研究与开发意义尤为重要，为细菌性阴道病治疗提供了一种全新的、安全的、有效的治疗手段。
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                                                            (2015-08-27