假丝酵母菌的主要致病菌［2］。对于该类妇科感染性疾病，临床上可用的抗真菌药物，在不正确的使用下，常常引起真菌对其耐药，使得VVC的治疗变得棘手。而假丝酵母菌的主要耐药机制有:药物的靶位发生变化、增强外排以及减少抗真菌药物的累积、真菌生物被膜的形成、真菌细胞壁组成的变化、钙调神经磷酸酶通路的参与及囊泡介导耐药等，本文将对以上耐药机制做一综述。

1 唑类药物作用靶位发生变化唑类药物抗菌机制：14α-去甲基化酶（14-α-

Detethylase，14-DM）由528个氨基酸构成，是真菌麦角固醇生成的关键酶。咪唑环或三唑环的第3位或第4位氮原子镶嵌在该酶的细胞色素P450蛋白的铁原子上，抑制14-DM的催化活性，使麦角固醇合成受阻，从而使真菌的细胞膜合成受阻，导致真菌细胞破裂死亡。在白假丝酵母菌中，目前已经克隆得到编14-DM的基因，并定为ERG11基因（也称为CYP51基因）。

1.1 基因突变 ERG11基因的突变会使14-DM结构发生改变，从而使药物的作用靶点改变。有人通过分析微粒体一氧化碳差异光谱发现，敏感菌株和耐药菌株的P450血红蛋白紫外吸收峰不同，而且耐药菌株对唑类药物的亲和力低，证实白

假丝酵母菌对唑类抗真菌药物的耐药性与微粒体细胞色素P450改变有关［3］。迄今为止，临床耐药的白假丝酵母菌分离株中大约有150个错义突变点［4］。例如：当发展成耐氟康唑菌株后，ERG11等位基因发生的R467K突变［5］；发生在酶的活性部位的突变点T315A。Sanglard等［6］报道Tyr132的错义突变会引起白假丝酵母菌耐药。这些突变位点单独或者协同作用阻止氟康唑与靶位点的结合，从而降低药物的亲和力，导致耐药发生［7］。Marichal

等［8］发现突变集中区域为：105-165、266-287、405-488位氨基酸区域所对应的核苷酸部位。ERG3的点突变会单独或者伴随着ERG11的突变出现，这些突变会导致细胞固醇生物合成中间产物的比率发生变化，而引起对唑类或者多烯类耐药。通过对光滑假丝酵母菌ERG5（CYP61）重组研究，发现唑类药物跟血红蛋白之间有联系，推测ERG5可能也是唑类药物作用的靶点，或许跟真菌耐药有

关［9］。已有研究发现临床分离的耐药白假丝酵母菌的ERG5发生单个基因突变，并且与ERG11基因有着重复的氨基酸序列。这种ERG5基因突变菌株不仅对唑类药物耐药，而且对对两性霉素B也产生耐药，其原因是细胞膜麦角固醇合成受阻，导致细胞膜中缺少两性霉素B的合位点，使真菌对两性霉素B产生耐药性

［10］。另外有研究发现，耐唑类药物的光滑假丝酵母菌，其ERG6基因亦存在错义突变［11］。总之，ERG11基因以及麦角固醇生物合成通路上的其他基因可能是通过同一作用机制使白假丝酵母菌对唑类耐药［12］。

1.2 靶酶基因的过度表达有研究显示，在很多对氟康唑耐药的临床菌株常常有EERG11基因的过度表达［13］。ERG11基因过度表达产生大量的靶酶，使得药物不能有效抑制其活性，从而使得真菌产生耐药。有研究发现，对唑类耐药的菌株ERG11基因拷贝数比敏感株多3.7倍，mRNA水平比敏感菌株高8倍，都证实了靶基因过度表达与唑类耐药的关系［10］。Upc2p是ERG11的转录因子，能上调ERG11基因和其他跟麦角固醇生物合成相关基因的表达［14］。有研究证实UPC2菌株导致假丝酵母菌对唑类产生耐药，而UPC2菌株却是对唑类药物高度敏感。另外一项研究表明唑类耐药菌株的UPC2基因编码区发生突变，导致ERG11基因过度表达，从而导致对唑类高度耐药［13，15］。

2 外排泵过度表达

2.1 外排泵过度表达根据人类基因组组织（human genome organization，HUGO）采用的命名方式，ABC转运蛋白可以分为9种（从A到I）［16］。而在酵

母菌中主要存在的类型是ABCB（MDR）［17］ , ABCC（MRP）［18］和ABCG（PDR）［19］，这些转运蛋白常常跟抗真菌药物耐药有关。整个ABC蛋白分子由2个

（或者 3 个）跨膜区域（transmembrane domains，TMDs）和2个核苷酸结合域（nucleotide binding domains，NBDs）构成。NBDs 连接并水解 ATP 来为TMDs内的药物泵提供能量，将药物从细胞内泵到细胞外，降低细胞内抗真菌药物的浓度。每个TMD由形成药物结合位点的a螺旋组成和6个跨膜片段组成［19］。在白假丝酵母菌中，PDR转运蛋白亚家族包括 7 名成员：Cdr1p, Cdr2p, Cdr3p,

Cdr4p, Cdr11p, CaSnq2p和Ca4531。在白假丝酵母菌中，Cdr1p 和 Cdr2p 是多种药物的转运子，而Cdr3p和Cdr4p被认为既不是药物泵也跟真菌耐药没有明确的联系［19］。Cdr1p, Cdr2p分别由位于白假丝酵母菌3号染色体上的CDR1和CDR2编码。有研究显示，CDR1和CDR2同时表达比CDR1单独表达引起的白假丝酵母菌耐药性更高［20］。有研究证实CDR1基因与唑类的耐药性之间确实存在

密切的关系［21］。在耐药假丝酵母菌株中,CDR1基因的mRNA水平可增高5～8倍。Prasad等［19］在分离的耐唑类药物菌株中发现Cdr1p是白假丝酵母菌的主要药物转运蛋白，基因过度表达跟药物泵作用有直接的关系。目前发现的惟一与白假丝酵母菌耐药性有关的是易化载体超家族蛋白（major facilitator super⁃family，MFS）。根据亲水性不同以及系统发生学分析，将 MFS 蛋白分为两类：药物：H + 逆向转运体（DHA1）; 药物：H + 逆向转运体（DHA2）。DHA1转运体含有12个跨膜片段，而DHA2含有14个跨膜片段。MDR1是DHA1的一个亚家族，它是白假丝酵母菌的多重药物转运体。MDR1的同系化合物在光滑假丝酵母菌和都柏林假丝酵母菌中被发现并命名为 CgMDR1 和 CdMDR1 ［22-23］。研究显示CdMDR1是都柏林假丝酵母菌对氟康唑耐药的主要原因之一［22］。 CgMDR1在光滑假丝酵母菌的固有表达或许是该菌对唑类药物天然不敏感的原

因［23］。

2.2 外排泵表达的调节 TAC1（transcription acti⁃vator of CDR genes）基因是第一个被发现的介导白假丝酵母菌耐药基因调控的转录活化因子，其编码基因TAC1与ERG11基因相邻，位于白假丝酵母菌5号染色体左臂上。研究发现TAC1基因有2种等位基因：野生型和高活性型。野生型TAC1介导CDR1、CDR2 基因的上调；而高活性型则引起CDR1、CDR2基因持续高表达［24］。

3 生物被膜的形成

生物膜的特征性构成成分细胞外基质（extracellular matrix, ECM），是构成生物膜复杂立体结构的基础。ECM包裹不同种类菌细胞群体［25］ ,白假丝酵母菌ECM主要由4种生物大分子组成：蛋白质和糖蛋白类（55%［wt/wt］）, 碳水化合物（25% ［wt/wt］）, 脂类15% ［wt/wt］）, 核酸类（5%［wt/wt］）［26］。而ECM介导的耐药最主要是通过阻碍药物的渗透。尽管生物膜有空间异质性、有营养物质输入和废物排出的水通道［27］，但是抗真菌药物还是不能有效分布在生物膜的各个部分［28］，从而使抗真菌药物不能有效发挥抗菌作用。另外，有研究显示白假丝酵母菌ECM中，β-1,3-葡聚糖可以对唑类、棘白菌素类、多烯类抗真菌药物有隔断的作用，从而产生多重耐药［29］。Mukherjee 等［30］使用 CDR1/CDR2 基因双敲除和CDR1/CDR2/MDR1三基因敲除的变异株，研究生

物膜耐药性与基因表达之间的关系，认为与野生菌株相比，双敲除和三敲除的缺陷株在生物膜早期耐药性下降，而生物膜成熟以后耐药性没有差别，提示药物流出泵基因与早期生物膜的耐药性有关，而与成熟生物膜耐药性无关。

4 真菌细胞壁组成的变化

真菌对药物的敏感性不仅与膜的变化有关，还与真菌细胞壁组分的变化有关。真菌细胞壁成分由几丁质、β葡聚糖或α葡聚糖和各种糖蛋白组成。真菌细胞壁结构和功能的完整与真菌的生长密切相关，棘白菌素类（如卡泊芬净等）是惟一通

过非竞争抑制细胞壁 β-1，3-葡聚糖合成而发挥抗真菌作用，葡聚糖编码基因为FKS,FKS的突变会导致真菌对棘白菌素类敏感性下降，最终形成耐药［31］。而FKS的点突变是惟一发现的真菌对棘白菌素类耐药的机制［32-33］。例如，体外诱导的棘白菌素敏感性降低的白假丝酵母菌，经测序比较发现Fks1发生突变（Phe641 to Asp648）［34］。

5 钙离子通道相关的耐药机制

文献有报道认为钙调神经磷酸酶信号通路或许跟假丝酵母菌菌丝生长、药物耐药产生、毒力和应激反应有关［35-36］。钙调神经磷酸酶（Calcineurin，CaN）是高度保守，在真菌细胞内发挥脱磷酸化的作用，而且是丝／苏氨酸蛋白磷酸酶家族中惟一一个受 Ca 2 + ／钙调素（calmodulin，CaM）调节的磷酸酶。CaN介导的耐药主要是引起Erg3基因突变使有活性的△5，6去饱和酶合成障碍，而引起真菌细胞内蓄积的固醇中间产物转变为14α－甲基法尼醇（14methylfecosterol），而不是14α-methylergosta-8，24（28）-dien-3β，6α-diol。最近有研究发现通过联合使用钙通道阻滞剂和氟康唑，原来对氟康唑耐药（MIC=512μg/mL）的白假丝酵母菌（CA10,CA16）, MIC值降到1～2μg/mL。该研究显示，钙离子阻滞剂跟氟康唑的耐药性的消失有关［37］。另外，有文献显示钙离子和钙离子引导的信号通路中的化合物亦跟真菌耐药、真菌毒力有关［38-39］。

6 囊泡介导耐药

Maebashi等［40］在白假丝酵母菌的耐药菌株中发现许多小囊状空泡，直径150～400 nm,这些空泡未在敏感株中被观察到。通过电镜观察发现，大多数小囊状空泡在P-120（pellet fraction by centrifugation at 120）部分可见，由小囊状空泡导致的耐药性可能是一种新的耐药机制，这种囊泡状空泡可能与其他细菌中介导耐药的膜泡（membranevesicles）相似。

参考文献

［1］ Sobel JD. Vulvovaginal candidiasis［J］.Lancet,2007,369(9577):1961-1971.

［2］ Li L，Bedding S，Dongari-Bagtzoglou A．Candida glabrata：anemerging oral opportunistic pathogen［J］．J Dent Res，2007，86(3)：204-215.

［3］ Marichal P, vanden Bossohe H, Odds FC, et al. Molecular biological characterization of an azole-resistant Candida glablataisolate［J］. Antimicrob Agents Chemother , 1997, 41(10):2229-2237.

［4］ Morio F, Loge C, Besse B, et al. Screening for amino acid substitutions in the Candida albicans Erg11 protein of azole-susceptible and azole-resistant clinicalisolates: new substitutions and areview of the literature［J］. Diagn Microbiol Infect Dis, 2010,66(4): 373-384.

［5］ White TC. The presence of an R467K amino acid substitution and loss of allelic variation correlate with an azole-resistant lanosterol 14alpha demethylase in Candida albicans［J］. Antimicrob Agents Chemother，1997, 41(7): 1488-1494.

［6］ Sanglard D, Ischer F, Koymans L, et al. Amino acid substitution in the cytochrome P- 450 lanosterol 14a- demethylase(CYP51A1) from azole-resistant Candida albicans clinical isolates contribute to resistance to azole antifungal agents［J］. Antimicrob Agents Chemother ,1998, 42( 2) : 241-253.

［7］ Morio F, Loge C, Besse B, et al. Screening for amino acid substitutions in the Candida albicans Erg11 protein of azole-susceptible and azole-resistant clinical isolates: new substitutions and areview of the literature［J］. Diagn Microbiol Infect Dis,2010，66(4):373-384.

［8］ Marichal P, vanden Bossche H, Odds FC, et al. Molecular biological characterization of an azole- resistant Candida glablata［J］. Antimicrob Agents Chemother, 1997,41(10):2229-2237.

［9］ Lamb DC, Maspahy S, Kelly DE, et al. Purification, reconstitution, and inhibition of cytochrome P-450 sterol delta22-desaturase from the pathogenic fungus Candida glabrata［J］.Antimicrob Agents Chemother, 1999，43(7):1725-1728.

［10］ Martel CM, Parker JE, Bader O, et al. A clinical isolate of Candida albicans with mutations in ERG11 (encoding sterol 14alpha- demethylase) and ERG5 (encoding C22 desaturase) is cross resistant to azoles and amphotericin B［J］.Antimicrob Agents Chemother,2010, 54(9):3578-3583.

［11］ Vandeputte P, Tronchin G, Berge’s T, et al. Reduced susceptibility to polyenes associated with a missense mutation in the ERG6 gene in a clinical isolate of Candida glabrata with pseudohyphal growth［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2007，51

(3):982-990.

［12］ Henry KW, Nickels JT, Edlind TD. Upregulation of ERG genes in Candida species by azoles and other sterol biosynthesis inhibitors［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2000，44(10):2693-2700.

［13］ Flowers SA, Barker KS, Berkow EL, et al. Gain-of function mutations in UPC2 are a frequent cause of ERG11 upregulation in azole-resistant clinical isolates of Candida albicans［J］. Eukaryot Cell，2012（11）:1289-1299.

［14］ White TC, Silver PM. Regulation of sterol metabolism in Candida albicans by the UPC2 gene［J］. Biochem Soc Trans, 2005，33(pt5):1215-1218.

［15］ Hoot SJ, Smith AR, Brown RP, et al. An A643V amino acid substitution in Upc2p contributes to azole resistance in wellcharacterized clinical isolates of Candida albicans［J］.Antimicrob Agents Chemother, 2011，55( 2):940-942.

［16］ Verrier PJ, Bird D, Burla B, et al. Plant ABC proteins-a unified nomenclature and updated inventory［J］.Trends Plant Sci,2008，13(4):151-159.

［17］ Lamping E, Baret PV, Holmes AR, et al. Fungal PDR transporters: phylogeny, topology, motifs and function［J］.Fungal Genet Biol, 2010，47(2):127-142.

［18］ Pagant S, Halliday JJ, Kougentakis C, et al. Intragenic suppressing mutations correct the folding and intracellular traffic of misfolded mutants of Yor1p, a eukaryotic drug transporter ［J］.Biol Chem, 2010，285(47):36304-36314.

［19］ Prasad R, Goffeau A. Yeast ATP-binding cassette transporters conferring multidrug resistance ［J］.Annu Rev Microbiol,2012,66:39-63.

［20］ Gauther C, Weber S, Alarco AM, et al. Functional similarities and differences between Candida albicnas Cdr1p and Cdr2p

transporters［J］.Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47(5):

1543-1554.

［21］ Prasad R, Kapoor K. Multidrug resistance in yeast Candi⁃

da［J］. Int Rev Cytol, 2004, 242:215-248.

［22］ Moran GP, Sanglard D, Donnelly SM, et al. Identification and

expression of multidrug transporters responsible for flucon⁃

azole resistance in Candida dubliniensis ［J］.Antimicrob

Agents Chemother, 1988,42(7):1819-1830.

［23］ Sanglard D, Ischer F, Calabrese D, et al. The ATP binding cas⁃

sette transporter gene CgCDR1 from Candida glabrata is in⁃

volved in the resistance of clinical isolates to azole antifungal

agents［J］. Antimicrob Agents Chemother,1999, (43):2753-

2765.

［24］ Coste A, Turner V, Ischer F, et al. A mutation in Tac1p, a tran⁃

scription factor regulating CDR1 and CDR2, is coupled with

loss of heterozygosity at chromosome 5 to mediate antifungal re⁃

sistance in Candida albicans［J］.Genetics, 2006,172(4): 2139-

2156.

［25］ Reichhardt C, Ferreira JA, Joubert LM,et al. Analysis of the

Aspergillus fumigatus biofilm extracellular matrix by solid

state nuclear magnetic resonance spectroscopy［J］.Eukaryot

Cell,2015, 14(11):1064-1072.

［26］ Zarnowski R, Westler WM, Lacmbouh GA, et al. Novel entriesin a fungal biofilm matrix encyclopedia［J］.MBio, 2014, 5(4):

e01333-14.

［27］ Ramage G, Saville SP, Thomas DP, et al. Candida biofilms: an

update［J］. Eukaryot Cell,2005, 4 (4):633-638.

［28］ Van Acker H, Van Dijck P, Coenye T. Molecular mechanisms

of antimicrobial tolerance and resistance in bacterial and fun⁃

gal biofilms ［J］.Trends Microbiol, 2014, 22(6):326-333.

［29］ Nett JE, Crawford K, Marchillo K, et al. Role of Fks1p and ma⁃

trix glucan in Candida albicans biofilm resistance to an echino⁃

candin, pyrimidine, and polyene［J］.Antimicrob Agents Che⁃

mother , 2010, 54(8):3505-3508.

［30］ Mukherjee PK, Chandra J, Kuhn DM, et al.Mechanism of fluco⁃

nazole resistance in Candida albicans biofilms: phase-specific

role of efflux pumps and membrane sterols［J］. Infect Immun，

2003，71(8): 4333-4340.

［31］ Perlin DS. Resistance to echinocandin- class antifungal

drugs ［J］, Drug Resist Updat,2007，10( 3):121-130.

［32］ Park S, Kelly R, Kahn JN, et al. Specific substitutions in the

echinocandin target Fks1p account for reduced susceptibility

of rare laboratory and clinical Candida sp. isolates［J］.Antimi⁃

crob Agents Chemother, 2005，49(8):3264-3273.

［33］ Balashov SV, Park S, Perlin DS. Assessing resistance to the

echinocandin antifungal drug caspofungin in Candida albicans

by profiling mutations in FKS1［J］.Antimicrob Agents Che⁃

mother,2006，50( 6):2058-2063.

［34］ Park S，Kelly R , Kahn JN，et al．Specific substitutions in the

echinocandin target Fkslp account for reduced susceptibility of

rare laboratory and clinical Candida sp. isolates［J］．Antimi⁃

crob Agents Chemother, 2005，49(8)：3264-3273．

［35］ Chen YL, Yu SJ, Huang HY, et al. Calcineurin controls hyphal

growth, virulence, and drug tolerance of Candida tropicalis［J］.

Eukaryot Cell, 2014，13(7): 844-854.

［36］ Zhang J, Silao FG, Bigol UG, et al. Calcineurin is required for

pseudohyphal growth, virulence, and drug resistance in Candi⁃

da lusitaniae［J］.PLoS One, 2012,7(8): e44192.

［37］ Liu S, Yue L, Gu W, et al. Synergistic effect of fluconazole and

calcium channel blockers against resistant Candida albi⁃

cans ［J］.PLoS One,2016,11(3): e0150859.

［38］ Liu S, Hou Y, Liu W,et al. Components of the calcium-calci⁃

neurin signaling pathway in fungal cells and their potential as

antifungal targets ［J］.Eukaryot Cell,2015,14: 324-334.

［39］ Liu FF, Pu L, Zheng QQ, et al. Calcium signaling mediates anti⁃

fungal activity of triazole drugs in the Aspergilli［J］.Fungal

Genet Biol, 2015,81: 182-190.

［40］ Maebashi K, Kudoh M, Nishiyama Y, et al. A novel mechanism

of fluconazole resistance associated with fluconazole sequestra⁃

tion in Candida albicans isolates from a myelofibrosis pa⁃

tient ［J］.Microbiol Immunol, 2002, 46(5): 317-326.

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